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其实肉类颜色测量指南：肉类颜色研究方法GJ的问题并不复杂，但是又很多的朋友都不太了解，因此呢，今天小编就来为大家分享肉类颜色测量指南：肉类颜色研究方法GJ的一些知识，希望可以帮助到大家，下面我们一起来看看这个问题的分析吧！

原则：

有时需要纯化肌红蛋白，例如比较不同物种的肌红蛋白(Mb) 的自氧化速率。肌红蛋白（分子量约为16,949）可以很容易地从骨骼肌或心肌中纯化。其红色有利于色谱过程中的目视观察。该方法使用相对便宜的设备产生较高的肌红蛋白产量（Faustman 和Phillips，2001；改编自Wittenberg 和Wittenberg，1981 以及Trout 和Gutzke，1996 的早期方法）。

样品、试剂和溶液

1. 去除脂肪和麸质的牛肉块

2. 4C 均质缓冲液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）

3.氢氧化钠

4、硫酸铵

5. 透析缓冲液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0），4C

6. 4C 下的色谱洗脱缓冲液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）

写下

为了最大限度地减少铁肌红蛋白的形成，均质化和所有后续步骤应在0 至5C 和高pH（8.0 至8.5）下进行。

设备

搅拌器、纱布、4C 20,000g 速度离心机、透析管（截留分子量12,000 至14,000）、Sephracryl S-200HR 柱（30 2.5 至cm）、蠕动泵。需要额外的试剂和设备来确定蛋白质浓度，或根据其消光系数计算肌红蛋白浓度。

准备匀浆

1、将150克切碎的肌肉和450毫升均质缓冲液放入搅拌机中进行均质，高速运转1至2分钟。

2. 将匀浆均匀地分配到每个试管中，并在4C 下以3000 g 离心10 分钟。

3. 弃去池上清液并用氢氧化钠将所得上清液的pH调节至8.0。

4.用两层纱布过滤上清液，除去脂质和结缔组织颗粒。

沉淀肌红蛋白

1.将滤液饱和至70%硫酸铵浓度（472克硫酸铵/升滤液），用氢氧化钠调节pH至8.0，

搅拌1小时。

2. 将匀浆均匀分入每个试管中，4、18,000 g 离心20 分钟，除去沉淀的蛋白质。

3. 合并上清液并丢弃沉淀。

4、将上清液由70%浓度调节至100%硫酸铵饱和度（在上清液中另外添加228克硫酸铵/L），用氢氧化钠调节pH至8.0，搅拌1小时。

5. 将匀浆均匀分入各试管中，1000g 离心1 小时。 20,000 g，4C。弃去上清液并添加1 或2 mL 冰冷缓冲液以帮助回收沉淀。

肌红蛋白的透析和纯化

1. 将沉淀的肌红蛋白转移至透析管中，使用透析缓冲液（1体积蛋白质、10体积缓冲液）在4下透析24小时，每8小时更换一次缓冲液。

2. 使用蠕动泵，用色谱洗脱缓冲液（3 倍柱体积）平衡Sephacryl S-200 HR 柱。

3. 将透析液加入柱中，用层析洗脱缓冲液以60 mL/小时的流速洗脱肌红蛋白提取物。此步骤将血红蛋白与肌红蛋白分离。血红蛋白将首先以红/棕色带的形式洗脱。然后肌红蛋白作为清晰可见的深红色带洗脱。

4. 使用级分收集器收集含有肌红蛋白的级分。

肌红蛋白浓缩物

1. 对所有含有肌红蛋白的级分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。可使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳进行评估

肌红蛋白提取物的纯度，应产生分子量为17 kDa 的单一蛋白质条带。

2. 使用离心浓缩器浓缩肌红蛋白溶液。

3. 或者（替代步骤2），将肌红蛋白溶液饱和至100% 硫酸铵浓度（761 克硫酸铵/升溶液），将pH 调节至8.0，并将溶液搅拌1 小时。将溶液均匀分入试管中，并在4C、000 g g 下以20,000 g 离心1 小时。如上所述，弃去上清液并透析肌红蛋白。

4. 或者（步骤2 和3），可以通过超滤浓缩肌红蛋白，如Trout 和Gutzke (1996) 所述。

5. 测定肌红蛋白溶液的蛋白质浓度，分装并冷冻保存于-80C。

写下

这种肌红蛋白分离程序的产量相对较低，需要收集2至3个月才能获得大量肌红蛋白。

参考文献

福斯特曼，C. 和A. 菲利普斯。 2001.新鲜肉变色的测量。《食品分析化学最新协议》 F3.3 单元，S.J. 编辑施瓦茨，约翰威利父子公司，纽约。

特劳特，G.R.和D.A.古兹克。 1996.一种简单快速分离纯化氧合肌红蛋白的制备方法。肉类科学43：1-13。

维滕贝格，J. B. 和B. A. 维滕贝格。 1981.肌红蛋白的制备。方法酶。 76：29-42。

H. 从牛骨骼肌中分离线粒体

原则

线粒体分离包括三个步骤：细胞裂解、匀浆和离心。用蛋白酶处理骨骼肌显着促进线粒体释放，同时增加产量。

试剂

1. 1 M 蔗糖：将342.3 g 蔗糖溶解于1 L 蒸馏水中，混匀，分成20 mL 等份，-20C 保存。

2. 0.1 M Tris/MOPS：将12.1 克Tris [三(羟甲基)氨基甲烷]溶解在500 mL 蒸馏水中并调节pH

7. 使用MOPS [3-(N-吗啉代)丙磺酸]粉末，将溶液定容至1 L，并在4C 下保存。

3. 1 M Tris/盐酸：将121.14 g Tris 溶解于500 mL 蒸馏水中，用盐酸调节pH 至7.4，稀释溶液

稀释至1 L 并在室温下保存。

4. 1 M EDTA：将372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶解在500 mL 蒸馏水中，并保存在4C 下。

5. 10% BSA：将10 g BSA（牛血清白蛋白）溶解于100 mL 蒸馏水中，-20C 保存。

7. 10mMEDTA：将2.92g EDTA 溶解在1L 蒸馏水中，并保存在4C 下。

8. 0.5% BSA：将5 g BSA 溶解在1 L 蒸馏水中，并保存在-20 C 下。

9. Nagase：制备浓度为20 mg/100 ml分离液（即20 mg/100 ml）的Nagase溶液。

重要提示：其他蛋白酶（胰蛋白酶）的选择取决于研究者的偏好和方案，以及用于分离线粒体的蛋白酶。

肌肉类型。

关键步骤3：在实验当天准备所有缓冲液，以避免细菌/酵母在储存的缓冲液中生长。

关键步骤4：由于pH 值取决于温度，因此所有溶液的pH 值均应在25C 下测量。

操作步骤

1. 取5克（精确至0.1克）目标肌肉组织样本，确保其不含可见脂肪或结缔组织，然后切成小块。

2. 取一个小烧杯，将肌肉组织浸入20 ml 冰浴PBS（磷酸盐缓冲盐水）中，并添加10 mM EDTA。

3.用剪刀将肌肉剪成小块。

4. 用含有10 mM EDTA 的冰冷PBS 缓冲液清洗切碎的肌肉2-3 次。

5. 将切碎的肌肉重悬于5 ml 含有10 mM EDTA 的冰冷PBS 中。

6. 200 g 离心5 分钟，弃去上清液。

重要提示：组织与分离缓冲液的最佳比例范围为1:5 至1:10 (w/v)。

8. 使用Potter-Elvehjem 研磨机和特氟隆研杵，以1,600 rpm 的转速将肌肉组织均质化；

将有纹理的肌肉捣碎10 至20 次。

重要提示：开始实验前5 分钟在冰浴中预冷玻璃器皿。均质化和后续步骤必须在4C 下进行，以尽量减少磷脂酶和蛋白酶的激活，从而避免对肌肉造成损伤。

9. 将匀浆转移至50 mL 聚丙烯Falcon 管中，并在4C 下以700 g 离心10 分钟。

10. 将上清液转移至玻璃离心管中，并在4C 下以8000g 离心10 分钟。

14. 使用双缩脲/布拉德福德方法之一确定线粒体浓度：二辛可宁酸测定(BCA)。

参考文献

Bhattacharya、S.K.J.H. Thakar、P.L. Johnson 和D.R. Shanklin。 1991.使用含有EDTA 和Nagarse 的离子介质从仓鼠中分离骨骼肌线粒体。分析生物化学192：344349。

Frezza, C.S. Cipolat 和L. Scorrano。 2007.小鼠肝脏、肌肉和培养成纤维细胞中线粒体的分离和功能。

纳特。协议。 2：287-295。

Mohan, A.M.C. Hunt、S. Muthukrishnan、T. A. Houser 和T. E. Barstow。 2010c.通过分区的乳酸和苹果酸脱氢酶研究肌红蛋白氧化还原形式的稳定性。农业和食品化学杂志58：70217029。

我。完整肌肉或碎肉的耗氧量

原则

新切的肉块经过标准化的氧气处理（即允许完全氧化），然后真空包装。由酶促呼吸引起的氧化肌肉组织（OMb）的减少可作为组织消耗氧气能力的衡量标准。在25C 水浴或培养箱中，立即记录400-700 nm 波长范围内的反射光谱，20 分钟后再次测量。氧合肌红蛋白水平通过K/S转换公式计算。详细信息请参见第9 节。 K/S 610/K/S 525 比率越高，OMb 含量越高。耗氧量(OC) 以第一次和最后一次测量之间的百分比差异表示。

设备及用品

1、真空包装机

2、聚氯乙烯薄膜

4. 能够扫描和记录400 至700 nm 表面反射率的分光光度计（参见第IX 节）

操作步骤

1、例如所有待测样品必须处于同一温度（4），否则温度越高，样品耗氧越快，藻华发展（即富氧）越慢；温度越低，氧气消耗越慢，藻类繁殖的速度就越快。

2. 为保证供氧均匀，所有样品均需保存在2-4C。对于完整的肌肉样品，用锋利的刀切割3厘米3厘米2厘米的样品块，尽可能去除可见的脂肪和结缔组织。对于磨碎的样品，应制备体积相当的均匀压实的立方体，其可见脂肪含量与样品瘦肉部分的典型水平相当。记住使用钝的工具以避免损坏表面结构。还要避免过度处理或挤压地面样本的表面（参见Madhavi 和Carpenter，1993）。

3. 如果表面不是新鲜切割的，则在开始开花步骤之前仅去除薄薄的表面层以暴露新鲜组织。

4. 用一小片透气薄膜覆盖新切割的表面，以防止其干燥。铺一层聚氯乙烯薄膜（常用），保证表面均匀暴露在空气中。记录膜的透气性。

5. 在2 至4 C 下显色2 小时（或其他标准时间）。在此步骤中请注意将所有样品保持在相同的温度，因为显色非常依赖于温度。

6. 花朵盛开后，除去PVC薄膜，将样品放入透氧性极低的袋子中。采用高真空进行快速真空包装；保持样品之间均匀的真空。

7. 立即扫描样品表面，测定400 至700 nm 范围内的反射率，以确定初始OMb。光谱仪必须通过真空袋膜进行校准。

8. 为加快耗氧速度，可使用25培养箱或水浴锅。 20 分钟（或根据所用肉类的适当标准时间）后重新扫描同一表面。

计算

%OMb=[K/S 610K/S 525 (100%DMb)]-[K/S 610K/S 525(样品)][K/S 610K/S 525(100%DMb)]-[K/S 610K/S 525(100%OMb)][100]。

耗氧量=[(初始OMb% 最终OMb%) 初始OMb%] 100。

写下

Madhavi 和Carpenter (1993) 提出了一种使用反射光谱仪测量耗氧量(OC) 的检测方法。该方法使用配备反射光谱附件的分光光度计首先测量真空包装样品的表面有机物（OMb）含量，然后在4下以5分钟的间隔（总共20分钟）重复测量。调整样品尺寸（2.5 2.5 0.5 cm）以适合反射光谱仪的样品接口。有机物相对浓度的计算采用Krzywiecki (1979)的方法，但Tang等人。 (2004)对其进行了改进并建议修改波长参数（详细信息请参见第9 节）。耗氧量表示为真空包装样品在10 分钟内消耗的表面有机物初始量的百分比。

Mancini、Hunt 和Kropf (2003) 报告了一种使用610 nm 反射率直接测定OMb 的方法。这是可能的，因为OMb 在610 nm 处具有独特的反射率，与DMb 和MMb 等渗（有关肉类表面反射率测量和K/S 比率的进一步讨论，请参见第IX 节）。该方法已被成功使用（参见King et al. 2011）。

一些研究采用单位时间内有机物（OMb）的百分比变化值来报告实际“耗氧量”，但这种方法繁琐且耗时。对于大样品，“耗氧量”通常计算为样品初始有机物含量的“平均下降百分比”。样品脱氧时间需要标准化，通常20分钟即可检测出样品差异。

参考文献

金，D.A.S.D.沙克尔福德，A.B.罗德里格斯，和T.L.惠勒。 2011.测量时间对肌红蛋白还原活性和耗氧量之间关系的影响以及长肌肉颜色稳定性的仪器测量。肉类科学。 87:26-32。

Madhavi，D. L. 和C. E. 卡彭特。 1993. 老化和加工影响牛肉肌肉颜色、高铁肌红蛋白还原酶和耗氧量。 J.食品科学。 58：939-942。

曼奇尼(R. A.)、M. C. 亨特(M. C. Hunter) 和D. H. 克罗普(D. H. Cropp)。 2003. 牛肉表面氧合血红蛋白含量的610 nm 反射率估计。肉类科学。 64：157-162。

Mohan, A.M.C. Hunt、T. J. Barstow、T. A. Houser 和D. M. Hueber。 2010a.通过近红外血氧测定法检测三个强直后骨骼肌中肌红蛋白的氧化还原形态。食品化学。 123：456464。

Tang, J.C. Forstmann 和T. A. Hoagland。 2004. Krzywiecki 重新审视水性肉类提取物中肌红蛋白氧化还原形式的分光光度测定方程。食品科学杂志69：C717C720。

J. 整肉或肉末的肌红蛋白降低能力

原则

首先将样品切片浸入稀硝酸钠溶液中20分钟，氧化表面色素生成甲基甲基蓝（MMb）。然后将切片（厚度1.27 cm）真空包装并在30C 下测量K/S。

比率（572/525 nm 波长）连续监测表面MMb 含量2 小时。样品的还原能力定义为孵育期间表面MMb 浓度下降的百分比。 MMb浓度下降的程度可视为组织还原血红素铁能力的反映。

试剂

1. 0.3%（w/w）亚硝酸钠溶液：称取一个大烧杯，加入3.0 g NaNO 2 到烧杯中，加蒸馏水至1000 g，每天新鲜配制，室温孵育。

操作步骤

1. 取3cm3cm2cm的肌肉组织样本（无可见脂肪或结缔组织）。如果使用碎肉，取一个大小相似的样品并压紧，以防止样品浸入时破裂。

2. 始终首先确定样品的方向以确定稍后要评估的表面。该表面可能是一个新切片，也可能是

显示面。

3.2 将样品浸入0.3% NaNO中。将样品在室温下浸泡在0.3% NaNO 溶液中20 分钟以诱导MMb 的形成。磨碎的样品可以放置在小屏幕上，以帮助降低和提升立方体，同时最大限度地减少碎片。

4. 从烧杯中取出样品并用布擦去多余的溶液。尽可能保留三维形状，并将待评估的表面放入防水袋中并真空包装（真空均匀）。真空可能会使样品稍微变平或变圆。

5. 立即扫描400 至700 nm 的反射率，以确定表面上形成的MMb 的初始量。保持表面完整性。

6. 将样品放入30C 培养箱中，2 小时后重新扫描以确定MMb 的剩余量。

计算

%MMb=[K/S 572K/S 525 (100% DMb)]-[K/S 572K/S 525 (样品)][K/S 572K/S 525 (100%DMb)]-[K/S 572K/S 525 (100% MMb)][100]。

MRA（MMb 减少百分比）=[（初始%MMb 最终%MMb） 初始%MMb] 100 或使用初始MMb 作为MRA 指标（参见下面的注释）。

写下

有研究者(McKenna et al. 2005; Mancini et al. 2008)指出，亚硝酸钠溶液中氧化反应生成的MMb初始量可以作为样品MRA的良好指标。然而，金等人。 (2011)发现MMb的减少百分比比其初始发电量更具参考价值。因此，建议同时收集并统计分析培养过程中MMb的初始产量及其减少百分比。

参考文献

金，D.A.S.D.沙克尔福德，A.B.罗德里格斯，和T.L.惠勒。 2011.测量时间对肌红蛋白还原活性和耗氧量之间关系的影响以及长肌肉颜色稳定性的仪器测量。肉类科学。 87:26-32。

曼奇尼(R.A.)、M. 塞弗特(M. Seifert) 和M.C.猎人。 2008. 牛肌肉中一氧化氮的数据呈现、样品位置和氧分压

对血红蛋白形成和高铁肌红蛋白还原活性测量的影响。肉类科学七十九：244251。

McKenna, D. R.P. D. Mies、B. E. Baird、K. D. Pfeiffer、J. W. Ellebracht 和J. W. Savell。 2005. 对19 种牛的影响

表征肌肉变色的生化和物理因素。肉类科学。 70：665682。

Mohan, A.S. Muthukrishnan、M.C. Hunt、T. J. Barstow 和T. A. Houser。 2010d.高铁肌肉苹果酸脱氢酶还原

红色蛋白质的动力学。农业和食品化学杂志58：6994-7000。

雷恩斯，C.R.M.C.亨特，J.A. Unruh，2010。具有不同颜色稳定性的肌肉对牛肉整体颜色稳定性的贡献。食品科学杂志75：C85-C89。

Sammel，L.M.M.C. Hunt，D. H. Kropf，K. A. Hachmeister，C. L. Kastner 和D. E. Johnson。 2002b.肉牛。

半膜内外化学性质对颜色性状的影响。 J.食品科学。 67：1323-1330。