更新时间：作者：小小条
免疫组化实验流程环环相扣，任何一步的疏忽都可能导致前功尽弃。本文将按照典型操作流程，串联关键步骤，并集成常见“坑点”与解决方案，形成一份实用的操作指南。
第一步：样本制备与切片处理。 这是实验的起点，至关重要。
① 脱蜡与水化：石蜡切片必须彻底脱蜡。建议将切片在60℃烘烤20分钟后，立即放入新鲜的二甲苯中操作，并确保后续梯度乙醇（如100%、95%、80%）也是新鲜配制的，以保证充分水化，否则会影响抗体渗透。
② 抗原修复：根据目标抗原特性，选择热修复（柠檬酸缓冲液、EDTA等）或酶修复（蛋白酶K、胰蛋白酶等），并优化修复时间和强度。过度修复可能破坏抗原，修复不足则导致信号弱。
第二步：阻断与封闭。
① 内源性酶阻断：对于HRP系统，常用3% H₂O₂处理以消除内源性过氧化物酶活性；对于AP系统，则使用左旋咪唑。
② 非特异性位点封闭：使用与二抗同源的非免疫血清（如5%山羊血清）或BSA进行封闭，时间通常为30-60分钟，可有效降低背景。
第三步：抗体孵育。
① 一抗孵育：使用优化后的工作浓度，4℃过夜孵育效果通常优于室温短时孵育。孵育时确保切片水平，并保持湿润。
② 洗涤：孵育后需用PBS或TBST充分洗涤，以去除未结合及非特异性结合的抗体。建议采用三次，每次5分钟的洗涤方式。
③ 二抗孵育：根据一抗种属选择对应的酶标或荧光标记二抗，室温避光孵育30-60分钟。同样需要充分洗涤。
第四步：显色与复染。
① 显色：对于DAB显色，需新鲜配制底物工作液，并在显微镜下控制显色时间，及时终止反应（浸入蒸馏水或PBS），防止背景过深或过显。
② 复染：常用苏木精对细胞核进行复染，提供组织形态学对照。复染后需再次蓝化（返蓝）。
第五步：封片与观察。 脱水透明后，用中性树胶封片。对于荧光样品，需使用抗淬灭封片剂，并尽快观察。
贯穿始终的注意事项：
① 设置对照：每批实验必须同步运行阳性对照和阴性对照（如用PBS代替一抗）。
② 防止干片：从脱蜡到封片前，任何时候都不应让切片完全干燥。
③ 试剂分装与标记：不同抗体、不同批次的试剂应清晰标记，避免混淆。
亚科因生物（ABBKINE） 提供的完整解决方案，正是为了简化这一复杂流程。例如，我们的免疫组化检测试剂盒，将优化好的抗体、显色系统、甚至必要的对照品集成在一起，并附有流程图式的说明书，*降低了操作门槛。自成立以来，ABBKINE已建立了从研发到生产的完整体系，其产品通过全球分销网络，服务于众多高校、研究院所和医院。我们相信，将专业的试剂与清晰的操作指南相结合，能帮助每一位研究者，尤其是刚入门的科研人员，更稳健地迈出探索的第一步
版权声明：本文转载于今日头条，版权归作者所有，如果侵权，请联系本站编辑删除